Влияние иммобилизации на ферментативную активность. Иммобилизация часто приводит к резким изменениям основных параметров ферментативной реакции: максимальной скорости (Vmax); константы Ми-хаэлиса (К ); оптимума pH и температуры, а также отношения к ингибиторам.
Степень и природа этих изменений зависят не только от используемого метода иммобилизации, но и от типа ферментативной реакции. Большое влияние на ферментативную активность может оказывать полимерная матрица, причем это влияние может проявляться как в виде воздействия на микроокружение фермента, так и непосредственно на саму молекулу фермента. Кроме того, сами условия иммобилизации (значение pH, присутствие свободных радикалов, окисляющих агентов и т. п.) могут приводить к частичной или полной инактивации фермента.
При рассмотрении влияния иммобилизации на ферментативную активность одним из важных является вопрос об эффективных кинетических параметрах.
Параметры Кти Vmix, используемые для характеристики каталитических свойств ферментов в разбавленных растворах (см. разд. 8.2), не могут быть применены в их строгом математическом значении для характеристики иммобилизованных ферментов, т. к. наблюдаются существенные отклонения от гиперболической субстратной кривой, описываемой уравнением Михаэлиса- Ментен, и искривления прямолинейных графиков в двойных обратных координатах (уравнение Лайнуивера-Берка).
Таблица 8.4. Иммобилизация некоторых ферментов известными методами [М. Е. Бекер. Введение в биотехнологию, 1978]
|
Метод иммобилизации |
Шифр фермента |
Наименование |
|
Адсорбция или ионный обмен |
1.11.1.6 |
Катал аза |
|
3.2.1.21 |
Р-Глюкозидаза |
|
|
3.2.1.26 |
Инвертаза |
|
|
3.4.23.1 |
Пепсин |
|
|
3.4.21.4 |
Трипсин |
|
|
Влючение в гель (полиакриламидный) |
3.5.1.1 |
Аспарагиназа |
|
1.1.1.27 |
Лактатдегидрогеназа |
|
|
1.1.3.4 |
Глкжозооксидаза |
|
|
1.11.1.7 |
Пероксидаза |
|
|
3.2.1.1 |
а-Амилаза |
|
|
3.2.1.2 |
р-Амилаза |
|
|
Поперечная пришивка фермента к носителю |
3.2.21.4 |
Трипсин |
|
Прикрепление фермента к носителю |
1.1.1.27 |
Лактатдегидрогеназа |
|
ковалентной связью |
1.1.3.4 |
Гл юкозооксидаза |
|
Азидным методом |
1.11.1.7 |
Пероксидаза |
|
3.4.21.4 |
Трипсин |
|
|
Карбоимидным методом |
3.2.1.26 |
Инвертаза |
|
3.4.21.4 |
Трипсин |
|
|
3.5.1.1 |
Аспарагиназа |
|
|
Бромциан-методом |
1.1.3.4 |
Глкжозооксидаза |
|
1.11.1.7 |
Пероксидаза |
|
|
3.4.21.4 |
Трипсин |
|
|
Методом диазотирования |
3.1.1.7 |
Ацетилхолинэстераза |
|
3.1.1.8 |
Холинэстераза |
|
|
3.5.1.1 |
Аспарагиназа |
|
|
1.1.3.4 |
Глкжозооксидаза |
|
|
Изотиооиатный метод |
1.11.1.6 |
Катал аза |
|
1.11.1.7 |
Пероксидаза |
|
|
3.2.1.1 |
а-Амилаза |
|
|
3.4.21.4 |
Трипсин |
|
|
3.2.1.2 |
р-Амилаза |
По этой причине в случае иммобилизованных ферментов лучше заново определить физический смысл данных кинетических параметров. Ранее с этой целью использовался параметр «кажущаяся» Кт, но позднее было предложено пользоваться двумя константами: Kw и V .