Сельскохозяйственная биотехнология-стр.257

микроинъекцня ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер у 2-клеточного эмбриона;

введение ДНК с использованием ретровирусных векторов; получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и эмбрионов.

Наиболее распространен метод микроинъекции ДНК. Два других метода имеют ряд ограничений и пока не нашли применения на сельскохозяйственных животных.

Для микроинъекции эмбрионов необходим устойчивый стол, на котором устанавливают инвертированный микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. Эмбрионы фиксируют посредством пониженного давления на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором ДНК. Пипетку вводят в пронуклеус через прозрачную оболочку и клеточную мембрану и затем инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК. О точности операции судят по набуханию пронуклеуса. Увеличение объема пронуклеуса свидетельствует о том, что раствор ДНК действительно введен. После инъекции эмбрионы освобождают от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.

В оплодотворенных яйцеклетках мыши и кролика, извлеченных в соответствии со стадией их развития, пронуклеусы очень хорошо видны и могут быть легко инъецированы. У эмбрионов сельскохозяйственных животных в цитоплазме имеются темные липидосодержащие гранулы, которые затрудняют визуализацию пронуклеусов. В результате центрифугирования при 15000 g/мин в течение 3-5 мин гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклетки, а лежащие недалеко от центра пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций. Для эмбрионов овцы, как правило, не требуется центрифугирования: для визуализации пронуклеусов достаточно применить оптику Номарского с интерференционным контрастом. Несмотря на сложную обработку (центрифугирование), микроинъекция эмбрионов сельскохозяйственных животных все же сложнее и не может быть выполнена с такой же надежностью и эффективностью, как у мышей и кроликов.

Другие материалы

Сельскохозяйственная биотехнология-стр.366

Регуляторная подготовка материнских растений. Сравнительно новым направлением фиторегуляции в биотехнологии растений является подготовка маточных растений, позволяющая значительно повысить эффективность ряда операций. Впервые этот прием разработан в лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений ТСХА для повышения приживаемости апикальных меристем картофеля и некоторых плодовых пород при их оздоровлении и микрокло-нальном размножении.