Сельскохозяйственная биотехнология-стр.190

Другой селективный маркер - ген, кодирующий дигидрофо-латредуктазу (ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий клетки. Благодаря экспрессии многих копий этого гена животная клетка вместе с плазмидой приобретает устойчивость к высоким концентрациям ингибитора фермента, и, таким образом, трансформантов можно отбирать при высоких концентрациях ингибитора.

Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры, работающие в нормальных клетках. Они построены по одному и тому же принципу: прокариотические гены, определяющие фенотип трансфицированных клеток, соединены с эукариотическими регуляторными сигналами. Первый вектор сконструирован путем встраивания клонированного бактериального гена, кодирующего ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазу (КГФРТ), между промотором и сайтом полиадени-лирования гена большого Т-антигена вируса SW 40. Наличие этого гена позволяет клеткам расти на селективной среде, содержащей микрофеноловую кислоту и ксантин (нормальные клетки утилизируют ксантин с очень низкой эффективностью).

Второй вектор состоит из прокариотического гена устойчивости к антибиотику неомицину (NeO), встроенного в раннюю область генома SW 40. Эукариотические клетки чувствительны к аналогу неомицина G418R, который инактивируется продуктом гена (NeOR). Таким образом трансфицированные клетки приобретают способность расти на среде, содержащей G418R.

Наличие селективных маркеров дает возможность вводить в клетки млекопитающих любой ген, если заранее лигировать его с клонированным селективным маркером. Однако дальнейшие исследования показали, что лигирование вне клетки не обязательно. Клетки, поглощающие селективный ген, вместе с ним поглощают и другую ДНК, имеющуюся в кальциевом преципитате. Таким образом, пользуясь методом котрансформации, практически любой клонированный сегмент ДНК можно ввести в культивируемые клетки эукариот, если включить эту ДНК вместе с селективным маркером в состав смеси для образования кальциевого преципитата.

Другие материалы

Технологические правила виноделия-стр.135

4-5 ч. По прошествии этого времени воду сливают, набухший клей размешивают до получения однородной тестообразной массы. Полученную массу протирают через густое волосяное или шелковое сито для удаления твердых частиц и волокон, приливая небольшими порциями холодную водопроводную воду при перемешивании из расчета получения раствора рыб ного клея массовой концентрации 100 г/дм3. При этом учитывают и тот объем воды, который пошел на набухание.