Сельскохозяйственная биотехнология-стр.190

Другой селективный маркер - ген, кодирующий дигидрофо-латредуктазу (ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий клетки. Благодаря экспрессии многих копий этого гена животная клетка вместе с плазмидой приобретает устойчивость к высоким концентрациям ингибитора фермента, и, таким образом, трансформантов можно отбирать при высоких концентрациях ингибитора.

Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры, работающие в нормальных клетках. Они построены по одному и тому же принципу: прокариотические гены, определяющие фенотип трансфицированных клеток, соединены с эукариотическими регуляторными сигналами. Первый вектор сконструирован путем встраивания клонированного бактериального гена, кодирующего ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазу (КГФРТ), между промотором и сайтом полиадени-лирования гена большого Т-антигена вируса SW 40. Наличие этого гена позволяет клеткам расти на селективной среде, содержащей микрофеноловую кислоту и ксантин (нормальные клетки утилизируют ксантин с очень низкой эффективностью).

Второй вектор состоит из прокариотического гена устойчивости к антибиотику неомицину (NeO), встроенного в раннюю область генома SW 40. Эукариотические клетки чувствительны к аналогу неомицина G418R, который инактивируется продуктом гена (NeOR). Таким образом трансфицированные клетки приобретают способность расти на среде, содержащей G418R.

Наличие селективных маркеров дает возможность вводить в клетки млекопитающих любой ген, если заранее лигировать его с клонированным селективным маркером. Однако дальнейшие исследования показали, что лигирование вне клетки не обязательно. Клетки, поглощающие селективный ген, вместе с ним поглощают и другую ДНК, имеющуюся в кальциевом преципитате. Таким образом, пользуясь методом котрансформации, практически любой клонированный сегмент ДНК можно ввести в культивируемые клетки эукариот, если включить эту ДНК вместе с селективным маркером в состав смеси для образования кальциевого преципитата.

Другие материалы

ПРИГОТОВЛЕНИЕ САХАРНОГО СИРОПА

Необходимое для подслащивания плодово-ягодного сока количество сахарного сиропа лучше приготовить заранее.

Например, нужно приготовить сироп из 5 кг сахара. Для этого в хорошо вымытую эмалированную кастрюлю емкостью около 10 л вливают 5 х 420 = 2100 мл воды и нагревают ее до 70-80 °С. В нагретую воду постепенно всыпают 5 кг сахара, продолжая нагревать посуду и размешивая ее содержимое, лучше всего большой деревянной ложкой. После растворения сахара сироп доводят до кипения и готовят около 10 минут, собирая с его поверхности пену, лучше всего плоской металлической шумовкой. После охлаждения получается 5 л так называемого нормального сиропа, содержащего 5 кг сахара, т. е. нормальный сироп в 1 л содержит 1 кг сахара.

Итак, проверим, согласуется ли это с предыдущими выводами: 1 кг сахара при растворении увеличивает объем жидкости на 600 мл; до растворения взято 420 мл воды, увеличение на 600 мл = 600 мл + 420 мл = 1020 мл, а практически получается 1000 мл или даже немного меньше, т. к. немного жидкости испаряется при приготовлении. Если сахар не очень чистый и вы хотите его кипятить дольше, следует взять немного больше воды, например 430-440 мл. Впрочем, если после приготовления из каждого килограмма сахара получится менее 1 л сиропа, можно добавить недостающее количество воды.

Внимание! Нормальный сироп имеет удельный вес 1,370, т. е. 1 л сиропа весит 1370 г. Поскольку он содержит 1000 г сахара, то (1000: 1370) х 100 = 73 %. Итак, нормальный сироп имеет весовое содержание сахара 73 %, что означает, что в 1 кг сиропа содержится 730 г сахара.

Такой сироп очень удобен для употребления и расчетов, однако имеет один недостаток - после остывания он кристаллизируется и немного сахара оседает на дно посуды. В этом случае надо немного подогреть сироп, тогда сахар вновь растворится. Если же вы не будете добавлять сироп сразу или не будет возможности его подогреть, а кристаллизации хочется избежать, перед приготовлением сиропа в него нужно добавить немного лимонной кислоты (0,7-0,8 г кислоты на 1 кг сахара). Такой сироп будет содержать сахар несколько «инвертированный», который не кристаллизируется даже в холодном сиропе.

В приведенном выше примере расчета на 5 кг сахара следовало бы добавить 5 ж 0,7 = 3,5 г лимонной кислоты.

Кроме нормального сиропа, можно также готовить и использовать сиропы менее густые, т. е. такие, в которых используется больше воды. Если, например, на 1 кг сахара берут 500 мл воды (практически нужно взять немного больше, а именно 520- 530 мл), получают 600 мл + 500 мл = 1100 мл сиропа, который содержит 1000 г сахара, т. е. в этом примере 1 л сиропа содержит примерно 900 г сахара.

Увеличивая количество воды, предназначенной для растворения 1 кг сахара, получают сироп все более жидкий, содержащий в 1 л все меньше сахара. Такие сиропы можно готовить без добавления кислоты.