Сельскохозяйственная биотехнология-стр.188

Вследствие сравнительно малого размера генома и короткого времени регенерации (несколько часов) экспериментировать с дрожжевыми клетками так же легко, как с большинством прокариот. Однако при этом можно исследовать весьма сложные генетические процессы, характерные для эукариот.

Процедура введения ДНК в клетки дрожжей не представляет сложности. Целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами и получают так называемые «сферопла-сты». Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС12 и полиэти-ленгликоля. При этом мембрана становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку.

Поскольку ряд генов дрожжей способен комплементировать мутации Е. coli, удалось достичь больших успехов в клонировании генов дрожжей. Для этого тотальную ДНК дрожжей после обработки рестриктазой клонируют в плазмиде и затем трансформируют этими плазмидами клетки Е. coli, несущие соответствующие мутации. Среди полученных трансформантов нетрудно отобрать те плазмиды, которые несут ген, комплемен-тирующий мутацию. Затем плазмиды можно использовать для трансформации сферопластов мутантных штаммов дрожжей.

Однако использование челночных векторов позволяет комплементировать мутации в самих дрожжевых клетках. Сконструированные челночные векторы содержат дрожжевой селективный маркер (Leu 3, his 3, ига Зит. п.), дрожжевой репликатор, обеспечивающий репликацию плазмиды в дрожжах, и бактериальный репликатор. Наиболее распространенные дрожжевые репликаторы выделены из 2 мкм-плазмиды дрожжей, хромосомной ДНК и митохондриальной ДНК.

Дрожжевую ДНК, расщепленную подходящей рестриктазой, клонируют в челночном векторе и размножают в Е. coli. Сферопласты дрожжей трансформируют смесью полученных плазмид. Плазмиды, комплементирующие мутацию в сферо-пластах-реципиентах, в селективных условиях можно отобрать, затем выделить и клонировать в Е. coli в больших количествах. Таким путем можно клонировать любой ген, для которого идентифицированы мутации.

Другие материалы