Сельскохозяйственная биотехнология-стр.182

Блот-гибридизация. При создании клонотек генов хромосомная ДНК фрагментируется с помощью рестриктаз. При этом неизвестно, содержат ли искомый ген сайт (или сайты) расщепления данной рестриктазой. Если такие сайты присутствуют, то выделить целый ген не удастся, и нужно использовать другую рестриктазу. Однако еще предварительно, без клонирования в бактериях можно исследовать структуру индивидуальных генов, определить наличие в них тех или иных сайтов рестрикции, установить число копий данного гена в геноме. Метод блот-гибридизации, используемый для этих целей, требует наличия соответствующей мРНК или кДНК-

Анализ проводят следующим образом (рис. 3.14). Высокомолекулярную хромосомную ДНК расщепляют рест-риктазой или их набором. Образовавшиеся фрагменты разделяют по длинам электрофорезом в агарозном геле, и гель помещают на лист нитроцеллюлозы. После этого направление электрофореза меняется на перпендикулярное (в направлении листа).

При этом ДНК из геля переходит на нитроцеллюлозу и получается как бы реплика с геля.

Затем проводят гибридизацию на фильтре фрагментов хромосомной ДНК с зондом.

Зонд гибридизуется только с теми фрагментами (полосами), которые содержат соответствующий ему ген. Полосы, с которыми связывалась метка, выявляют радиоавтографией.

Наличие на автографе одной полосы свидетельствует о том, что при реакции рестрикции ген не расщепляется, а интенсивность полосы дает возможность определить число копий гена в геноме. Таким образом, описанный метод может оказаться очень полезным для анализа гена или семейства генов с целью выбора оптимальной стратегии клонирования.

Аналогичный метод разработан для анализа клеточных мРНК с целью выяснения их полного или частичного соответствия зонду, а также для определения их числа. Метод называется «Северный блотинг». Здесь электрофорез проводят не с фрагментами ДНК, а с молекулами РНК, которые в присутствии формальдегида также разделяются по размерам, а потом гибридизуются с зондом. Метод является полезным дополнени