Сельскохозяйственная биотехнология-стр.181

После того как радиоактивный зонд получен, проводят сканирование геномной библиотеки или библиотеки кДНК, которое заключается в идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду. На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист нитроцеллюлозы; на него переходит часть бактерий с каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В результате и на чашке, и на фильтре колонии распределены одинаково. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК нитроцеллю-лозный фильтр обрабатывают NaOH, после чего прогревают его в вакуумной печи. В результате денатурированная ДНК прочно связывается с нитроцеллюлозой. Затем целлюлозу помещают в раствор, содержащий меченую кДНК или мРНК или синтетический олигонуклеотид. В условиях гибридизации метка связывается с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные зонду. Фильтр отмывают от несвязавшихся молекул и проводят радиоавтографию, которая и выявляет колонии, содержащие метку. Эти колонии идентифицируют на чашке Петри, отбирают и размножают.

Возможность выделения чистого белка позволяет осуществить и другой подход, основанный на получении антител против белка, ген которого требуется клонировать. При использовании

Рис. 3.13. Идентификация бактериальных колоний, содержащих плазмиду со вставкой специфической кДНК

векторов на основе бактериофагов бактерии, зараженные фагом, содержащим искомый ген, в небольшом количестве синтезируют кодируемый им белок. Поэтому библиотеку фагов можно просмотреть, используя препарат соответствующих антител, которые связываются с белком и тем самым позволяют идентифицировать клон с нужным геном. Скриннинг библиотеки осуществляется так же, как показано на рис. 3.13, с той разницей, что вместо меченой мРНК используются меченые антитела, которые также можно идентифицировать с помощью радиоавтографии. Этот же метод используется и при клонировании ДНК в экспрессируемых векторах (см. ниже).

Другие материалы

Пищевая химия-стр.284

Пектинэстераза (Н.Ф.3.1.1.11). Пектинэстеразы синтезируются высшими растениями, микроскопическими грибами, дрожжами и бактериями. Пектинэстераза катализирует гидролиз сложноэфирных связей в молекуле растворимого пектина, в результате чего образуется метиловый спирт и полигалактуроновая кислота. Процесс протекает согласно следующей схеме (стрелками показано действие фермента):