Сельскохозяйственная биотехнология-стр.179

Если кДНК в составе векторной молекулы способна к экспрессии, т. е. на ней синтезируется мРНК, а затем белок, то ген можно идентифицировать по его продукту с помощью специфического иммунохимического метода обнаружения белка. Таким образом, используя один из этих методов или их комбинацию, можно убедительно доказать, что получен именно нужный ген.

Мы рассмотрели случай, когда удалось выделить индивидуальную мРНК. Это возможно, если ген избирательно активен в определенных клетках и тканях. В этом случае реакцию обратной транскрипции проводят со смешанной популяцией мРНК и в результате получают кДНК, представляющую смесь обратных транскриптов со всех типов мРНК.

Создание банка кДНК. Теперь задача сводится к выбору из популяции молекул кДНК тех обратных транскриптов, которые представляют искомый ген. Чаще всего в этом случае прибегают к методу создания банка кДНК. Для этого с помощью линкеров молекулы кДНК сшивают с векторными молекулами и трансформируют ими бактериальные клетки. Причем опыт строится таким образом, что каждая бактериальная клетка получает только одну рекомбинантную плазмиду. В результате каждая бактериальная колония будет содержать только один вид кДНК- Далее отбирают единичные колонии и выращивают из них большие гомогенные культуры. Из клеток выделяют плазмиды, имеющие вид вставок кДНК. Плазмидную ДНК денатурируют (при этом нити ДНК расходятся), и денатурированную ДНК необратимо связывают (иммобилизуют) с нитро-целлюлозными фильтрами. Через фильтр пропускают исходную смесь мРНК, и те молекулы мРНК, которые комплементарны данной кДНК, в результате ренатурации связываются с фильт-

Рис. 3.12. Идентификация плазмид, содержащих в виде вставок специфически? кДНК с помощью ДНК - РНК-гибридизации на фильтрах ром. Таким образом, из смеси молекул мРНК можно выделить любую их фракцию (рис. 3.12).

Связавшуюся с фильтром мРНК можно элюировать (смыть) с фильтра и добавить к бесклеточной системе трансляции. Если при этом будет синтезироваться нужный белок, значит, данный бактериальный клон содержит в своих плазмидах искомый ген. Следует отметить, что чем представительней в популяции молекул мРНК транскрипты с искомого гена, тем легче его выделить описанным выше методом.

Другие материалы

Пищевая химия-стр.269

2. Если задача заключается в определении того, каким образом будет вести себя данный фермент (ферментный препарат) в конкретном режиме рассматриваемой пищевой технологии, необходимо проводить исследование ферментативного действия при условиях данного технологического процесса (концентрация субстрата, длительность, pH, температура, влажность), изучить влияние различных компонентов пищевого сырья и используемых добавок на активность фермента с целью определить возможность и способы влияния на ферментативный процесс в желаемом направлении.