Сельскохозяйственная биотехнология-стр.178

К полученной кДНК пристраивают липкие концы (см. рис. 3.4) и встраивают в плазмиду, например pBR322. Рекомбинантную ДНК вводят в Е. coli, где кДНК размножается. Подобная схема была использована для получения генов, кодирующих инсулин, гормон роста, интерферон, глобин, альбумин, иммуноглобулины и ряд других белков, производство которых уже налажено микробиологической промышленностью.

Для того чтобы убедиться, что получен именно тот ген, который требовался, существует несколько приемов. Если известна последовательность аминокислот белка, кодируемого геном, то,

Рис. 3.10. Синтез двуцепочечной кДНК на мРНК

Рис. 3.11. Идентификация плазмид, содержащих в виде вставок специфические кДНК с помощью ДНК - РНК-гибридизации на фильтрах определив нуклеотидную последовательность клонированной ДНК одним из методов секвенирования (см. рис. 3.3), можно убедиться, что она кодирует именно этот белок. Иногда применяют метод ДНК - РНК, гибридизации. Это возможно в том случае, если выделена индивидуальная мРНК (рис. 3.11). Молекулы кДНК подвергают денатурации (при этом нити ДНК расходятся) и смешивают с избытком мРНК. В условиях ренатура-ции (это процесс, обратный денатурации, при котором происходит восстановление двойной спирали, причем последняя может образоваться как из двух цепей ДНК, так и из цепи ДНК и комплементарной ей цепи РНК) будет происходить образование

176

гибридных ДНК-РНК-молекул. С помощью эндонуклеазы SI можно убедиться в их полной комплементарности, а значит, и в том, что получен именно тот ген. Если ДНК не полностью комплементарна РНК, то в гибридной молекуле будут одноцепочечные неспаренные участки, которые будут гидролизованы эндонуклеазой SI. Более простой вариант этого метода состоит в том, что в реакции гибридизации участвует суммарная, а не индивидуальная мРНК- В результате гибридизации с кДНК индивидуальная мРНК окажется в составе гибридных молекул. Тогда эта мРНК не сможет направлять синтез полипептидов в бесклеточной белоксинтезирующей системе, и по отсутствию сопутствующей белковой полосы после разделения электрофорезом можно убедиться в соответствии гена мРНК.

Другие материалы

Пищевая химия-стр.43

Глутатион принимает участие в транспорте аминокислот через мембраны клеток, обезвреживает соединения ртути, ароматические углеводороды, перекисные соединения, предотвращает заболевание костного мозга и развитие катаракты глаз.