Сельскохозяйственная биотехнология-стр.177

3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ

Выделение генов - один из главных этапов в генетической инженерии. Успех на этой стадии создания рекомбинантных ДНК зависит прежде всего от следующих факторов: насколько изучен данный ген и его положение в геноме донора; от разработки методов выделения мРНК данного гена и методов обнаружения функциональной активности продукта данного гена; существования объектов, в которых данный ген находится в больших количествах (амплифицирован) или в которых он особенно активен, что позволяет выделить достаточные количества его мРНК, которые можно использовать для получения ДНК этого гена путем обратной транскрипции. В принципе существуют два основных пути получения гена: либо ген синтезируют, либо из клонотеки отбирают ту рекомбинантную ДНК, которая содержит нужный ген.

Синтез комплементарной ДНК (кДНК). Осуществление первого пути стало возможным вследствие открытия фермента-обратной транскриптазы, или ревертазы. Этот фермент был выделен из некоторых РНК-содержащих онкогенных вирусов. Фермент осуществляет РНК-направляемый синтез ДНК, т. е. на молекуле РНК, как на матрице, синтезируется комплементарная цепь ДНК- Отсюда и название фермента - он катализирует реакцию, обратную первому этапу экспрессии гена - транскрипции.

Предположим, что нам удалось выделить гомогенный препарат мРНК, специфичной для определенного гена. В некото рых случаях, когда эта мРНК составляет существенную часть тотальной мРНК, это удается.

Эукариотические мРНК, как правило, содержат на своем З’-конце последовательность, состоящую из остатков адени-на - поли (А) последовательность. Для начала реакции ферменту нужна затравка в виде небольшого отрезка двуцепочечной ДНК. Если смешать короткие олигонуклеотиды, состоящие из остатка тимина (олиго-дТ), они будут гибридизоваться с поли(А) последовательностью, и такой дуплекс будет служить затравкой для начала ферментативной реакции. В результате образуется гибридная РНК-ДНК-молекула, причем на конце у нее будет короткий отрезок двуцепочечной ДНК - шпилька. Она может служить затравкой для синтеза второй цепи ДНК, который осуществляет фермент ДНК-полимераза I (рис. 3.10). С помощью эндонуклеазы SI, которая специфически гидролизует одноцепочечные участки ДНК, шпильку можно расщепить. В результате получится двуцепочечная молекула ДНК с одной из нитей комплементарной мРНК. Такую ДНК. называют кДНК, и она соответствует структурному гену, с которого транскрибировалась исходная молекула мРНК.

Другие материалы

Пищевая химия-стр.390

Тауматин Е957 - подсластитель, усилитель вкуса и аромата. Белковый продукт, выделенный из плодов Thaumatococus danielli (растения, произрастающего в Западной Африке). Самое сладкое из известных при родных веществ, слаще сахарозы в 1600-2500 раз. Определяющим фактором сладкого вкуса является четвертичная структура белка. Влияние температуры на степень сладости белка неоднозначно и зависит от pH среды, наличия солей и кислорода. Очень сильное влияние на степень сладости тауматинов оказывает присутствие в его молекуле ионов алюминия.