Сельскохозяйственная биотехнология-стр.170

Рис. 3.4. Сливание фрагментов ДНК с «одноименными» липкими концами

Сшивка по «тупым» концам. Липкие концы абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам.

Однако липкие концы можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к З’-концам цепей ДНК (рис. 3.5). Так, например, если к обоим З’-концам двуцепочечного фрагмента присоединить поли-дА, а к З’-концам другого фрагмента - поли-дТ, то при смешивании этих двух фрагментов между комплементарными одноцепочечными концами происходит спаривание. Для ковалентного соединения двух фрагментов используют ДНК-лигазу. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

Рис. 3.5. Сшивание фрагментов ДНК с «тупыми» концами

Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами.

В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, т. е. некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или «переходники»). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию (рис. 3.6). Существуют большие наборы таких генных «переходников». Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры не только обеспечивают объединение генов, но и

Другие материалы