Сельскохозяйственная биотехнология-стр.167

Сэнгер использовал ДНК-полимеразу I. В клетке этот фермент участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты

(дНТФ), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двуцепочечный участок - затравка, с которого начинается синтез.

Были синтезированы модифицированные предшественники - Дидезоксирибонуклеотиды для каждого из четырех оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК.

Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезокси-рибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ддНТФ). Поэтому их называют терминаторами элонгации.

Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить, короткого фрагмента меченой ДНК, комплементарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырех ддНТФ и соответствующего дНТФ в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех дНТФ. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ддНТФ. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов, длина которых соответствует местоположению одного из четырех оснований. Меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК (см. рис. 3.3).

Другие материалы

Мир томата глазами фитопатолога-стр.78

В коре расположены сосуды, которые расходятся по радиусам от цветоложа (фото 1-46, 2). На поперечном срезе они видны в виде тёмных точек (фото 1-47, а). Сосуды по радиусам отходят от места прикрепления плодоножки, доставляя воду и питательные вещества клеткам.